本文由奧科醫(yī)學(xué)學(xué)術(shù)團(tuán)隊(duì)劉濤博士撰文

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外泌體(Exosomes)是一種能被機(jī)體內(nèi)大多數(shù)細(xì)胞分泌的微小膜泡，具有脂質(zhì)雙層膜，直徑大約為30-150 nm。外泌體廣泛存在并分布于各種體液中，攜帶和傳遞重要的信號(hào)分子，形成了一種全新的細(xì)胞-細(xì)胞間信息傳遞系統(tǒng)，影響細(xì)胞的生理狀態(tài)并與多種疾病的發(fā)生與進(jìn)程密切相關(guān)。幾乎所有類(lèi)型的細(xì)胞都可以分泌外泌體，同時(shí)外泌體也廣泛存在于體液中，包括血液、眼淚、尿液、唾液、乳汁、腹水等。目前研究發(fā)現(xiàn)外泌體中富含核酸(MicroRNA、lncRNA、circRNA、mRNA、tRNA等)、蛋白、膽固醇等。外泌體的表面marker主要有CD63、CD81、CD9、TSG101、HSP27等。外泌體的產(chǎn)生過(guò)程為：細(xì)胞膜內(nèi)陷，形成內(nèi)體(Endosome)，再形成多泡體(Multivesicular bodies，MVB)，最后分泌到胞外成為外泌體。外泌體中攜帶有母細(xì)胞的多種蛋白質(zhì)、脂類(lèi)、DNA和RNA等重要信息。

外泌體是直徑30-100 nm的顆粒，所有類(lèi)型的細(xì)胞都能分泌。這些脂質(zhì)雙層顆粒富含膽固醇、神經(jīng)酰胺和磷脂酰絲氨酸，其脂質(zhì)含量與親本細(xì)胞不同。在大多數(shù)外體中普遍存在的標(biāo)志物包括Tetraspanins(CD9、CD63和CD81)；熱休克蛋白；粘附分子；以及ESCRT(運(yùn)輸所需的內(nèi)體分選復(fù)合物)途徑的標(biāo)志物，包括LAMP1和TSG101。

一.外泌體簡(jiǎn)介

1.外泌體內(nèi)容物

癌癥來(lái)源的外泌體含大量的內(nèi)含物，由microRNAs、mRNAs、轉(zhuǎn)錄因子、蛋白質(zhì)和脂質(zhì)等成。microRNAs是小的、非編碼的RNA，通常是20-25個(gè)核苷酸的長(zhǎng)序列，一旦進(jìn)入受體細(xì)胞，就與目標(biāo)mRNA序列結(jié)合并抑制翻譯。已發(fā)現(xiàn)miRNA在大多數(shù)癌癥中表達(dá)失調(diào)。不同細(xì)胞來(lái)源的外泌體的miRNA特征是不同的。許多miRNA是腫瘤特異性的，因此可以用作診斷和預(yù)后的生物標(biāo)記物。

外泌體的結(jié)構(gòu)和內(nèi)含物。外泌體是小的膜結(jié)合囊泡，與質(zhì)膜具有相似的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)。外泌體攜帶的脂質(zhì)雙層膜結(jié)構(gòu)含有典型的跨膜蛋白和受體，如跨膜蛋白PGRL、LAMP1/2、CD13，膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白如膜聯(lián)蛋白和RABS蛋白，粘附分子如ICAM-1、乳膠黏附和整合素，脂筏相關(guān)蛋白如Flotillins、LBPA、膽固醇、胃素和Tetraspanins，最具特征的是CD63和CD81。此外，胞外體膜表面還組裝有免疫調(diào)節(jié)分子，如MHC-I和-II、CD80和CD86。在外腔內(nèi)可以找到幾種穩(wěn)定和保存“信息”的外體貨物的蛋白質(zhì)：細(xì)胞骨架蛋白，HSPs，最典型的是HSP70，細(xì)胞骨架蛋白(Vimentin，cofilin，Tublin，Talin，actin)，代謝酶(GAPDH，A TPase，pgk1)，以及參與MVB形成的蛋白質(zhì)，如Alixs，Tsg101，clathrin。外泌體的內(nèi)容物可以在微環(huán)境中從原始細(xì)胞轉(zhuǎn)移到靶細(xì)胞，包括RNA種類(lèi)(mRNAs、miRNAs和其他類(lèi)型的短RNA)和大量不同的蛋白質(zhì)，取決于它們的宿主細(xì)胞。

2.外泌體釋放途徑

外泌體是一類(lèi)囊泡，其分泌途徑包括有效載荷及與血管內(nèi)皮的融合。有證據(jù)表明，有兩類(lèi)血管內(nèi)皮細(xì)胞：富含膽固醇的分泌型血管內(nèi)皮細(xì)胞(SMVEs)和容易與溶酶體融合的低膽固醇血管內(nèi)皮細(xì)胞(LMVEs)。微泡產(chǎn)生于損傷或轉(zhuǎn)化細(xì)胞的膜脫落。凋亡小體或凋亡體是從垂死的細(xì)胞或凋亡后殘留的細(xì)胞體中脫落的囊泡。這些EVS的膜脂含量更接近于起源細(xì)胞的質(zhì)膜。外泌體也包括來(lái)自高爾基復(fù)合體的脂質(zhì)，使它們與質(zhì)膜更加不同。

3.外泌體生物標(biāo)志物

細(xì)胞外蟆泡可基于其起源或大小分為凋亡小體、微泡體和外泌體。外泌體是其中最小且最具特征的囊泡，由不同種類(lèi)細(xì)胞分泌釋放，包括神經(jīng)細(xì)胞及其起源的腫瘤細(xì)胞，在神經(jīng)系統(tǒng)中發(fā)揮重要功能。從血液和腦脊液中提取的外泌體是真核細(xì)胞用于交換蛋白質(zhì)unRNA和微小RZA等生物學(xué)信息的載體，這些生物分子參與細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、腫瘤細(xì)胞增殖遷移及血管生成。外泌體不僅是一種新的生物學(xué)標(biāo)志物檢測(cè)方法，更可提供潛在的分子治療靶點(diǎn)，并且有望成為抗腫瘤藥物傳遞的載體。

二.外泌體研究分析

1.外泌體和腫瘤干細(xì)胞

近年來(lái)，腫瘤干細(xì)胞(CSC)模型被提出并受到越來(lái)越多的關(guān)注。集體研究表明，這些CSCs可以啟動(dòng)腫瘤再生。它們能夠自我更新，重現(xiàn)原始腫瘤的異質(zhì)性，并在免疫功能低下的小鼠身上分化為新腫瘤的整體。

Bonnet和Dick首次證明了人類(lèi)急性髓系白血病中CSCs的存在。這些細(xì)胞與正常造血干細(xì)胞相似，可向白血病克隆方向分化。該層次結(jié)構(gòu)與造血祖細(xì)胞的分化過(guò)程相似，提出了腫瘤治療中靶向CSCs的必要性。根據(jù)研究結(jié)果，美國(guó)癌癥研究協(xié)會(huì)在2006年提出了對(duì)CSC的一致定義，即“腫瘤內(nèi)具有自我更新能力的細(xì)胞，并導(dǎo)致組成腫瘤的癌細(xì)胞的異質(zhì)性譜系”。在殺死快速增殖的癌細(xì)胞的傳統(tǒng)治療下，CSCs保持自我更新，并增加腫瘤復(fù)發(fā)的風(fēng)險(xiǎn)。值得注意的是，集落進(jìn)化模型還表明，CSCs可能與最初的致瘤細(xì)胞不同。在疾病發(fā)展過(guò)程中，CSCs與莖相關(guān)的遺傳特征可能會(huì)發(fā)生一些變異，導(dǎo)致表型和功能的切換。因此，所謂的CSCs的致瘤特性只能用來(lái)指它們?cè)诋惙N移植中引起腫瘤的能力，而不能用來(lái)解決來(lái)源細(xì)胞的問(wèn)題。CSCs是腫瘤發(fā)生的根源，具有乳腺干細(xì)胞的共同特征，包括靜止、自我更新和分化潛能。自我更新能力使BCSC具有有效修復(fù)DNA損傷的生存優(yōu)勢(shì)，而分化潛能使BCSC具有致瘤能力。微環(huán)境成分，包括外體、趨化因子和細(xì)胞外基質(zhì)，也通過(guò)與BCSC表面標(biāo)志物的相互作用在維持表型方面發(fā)揮重要作用。這一作用通過(guò)細(xì)胞內(nèi)信號(hào)將多變的干細(xì)胞樣屬性與不同的腫瘤微環(huán)境緊密聯(lián)系在一起。這些頑固性腫瘤細(xì)胞中的異常表達(dá)提示CSCs可能是腫瘤體積中免疫抑制機(jī)制的重要組成部分。

BCSCs治療耐藥的主要可能機(jī)制。這些特征主要包括增強(qiáng)的自我更新能力(Notch、Wnt和HH信號(hào))，增強(qiáng)的抗凋亡能力(PI3K信號(hào))，增強(qiáng)的抗氧化能力(NRF2信號(hào))，增加抗癌藥物的外流(ABCG2)，低氧狀態(tài)(HIF-1信號(hào))，以及腫瘤微環(huán)境維持效應(yīng)(外體或趨化因子)。所有因素共同作用，導(dǎo)致了BCSC的耐藥表型。

2.外泌體和自噬

自噬是一種應(yīng)激反應(yīng)的分解代謝過(guò)程，溶酶體酶通過(guò)該過(guò)程降解細(xì)胞內(nèi)的成分。現(xiàn)在人們普遍認(rèn)為，自噬在細(xì)胞和組織的動(dòng)態(tài)平衡以及新陳代謝、發(fā)育和通過(guò)清除病原體而產(chǎn)生的免疫中起著至關(guān)重要的作用。有幾條降解途徑進(jìn)入溶酶體：一，微型自噬，胞漿物質(zhì)直接內(nèi)化到溶酶體后被降解；二，伴侶介導(dǎo)的自噬，通過(guò)它胞漿蛋白的子集被選擇性地降解；三，宏自噬(以下簡(jiǎn)稱(chēng)自噬)，處理胞質(zhì)物質(zhì)的分離和降解。自噬是由許多不同的生理刺激或病理生理情況引起的。它還在細(xì)胞質(zhì)的質(zhì)量控制中發(fā)揮作用，因?yàn)樗梢匀コ鞍踪|(zhì)聚集體、受損的細(xì)胞器(例如，有缺陷的線粒體)和細(xì)胞內(nèi)的病原體(細(xì)菌和病毒)。自噬參與細(xì)胞內(nèi)成分的水平調(diào)節(jié)和循環(huán)，如氨基酸、脂質(zhì)(脂滴)和碳水化合物，從而直接促進(jìn)細(xì)胞新陳代謝和能量調(diào)節(jié)。最后，自噬可以防止與衰老相關(guān)的細(xì)胞修飾。因此，這個(gè)復(fù)雜的膜通路，受許多因素調(diào)節(jié)，參與細(xì)胞策略，以保護(hù)生物體免受癌癥、感染性疾病以及代謝、肌肉、炎癥和神經(jīng)退行性疾病的侵襲。相反，自噬途徑的完全或部分失調(diào)會(huì)加重或?qū)е逻@些病理。

哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的自噬途徑。哺乳動(dòng)物細(xì)胞中溶酶體的降解有三條自噬途徑：CMA通過(guò)與溶酶體表面的蛋白LAMP-2A相互作用將底物轉(zhuǎn)移到溶酶體上。CMA需要底物上的靶向基序(KFERQ)；這個(gè)基序由伴侶Hsc70識(shí)別。微自噬通過(guò)直接內(nèi)陷溶酶體來(lái)隔離貨物。宏自噬涉及形成稱(chēng)為自噬小體的雙膜細(xì)胞器，貨物被隔離在其中(起始和延伸步驟)。自噬小體與溶酶體融合，在那里貨物被降解(成熟步驟)。自噬途徑有三個(gè)重要階段：自噬小體形成的起始階段(包括吞噬小體的形成)、伸長(zhǎng)/閉合階段(導(dǎo)致封閉的自噬小體的形成)和自噬小體的成熟(包括與溶酶體的融合)。構(gòu)成ATG蛋白質(zhì)核心機(jī)制的不同模塊由虛線分隔。能量耗竭、氨基酸和血清饑餓通過(guò)不同的信號(hào)通路激活ULK復(fù)合體，包括mTOR通路。噬菌體來(lái)自?xún)?nèi)質(zhì)網(wǎng)的一個(gè)區(qū)域，稱(chēng)為omegasome。omegasome的特征是存在PI3P結(jié)合蛋白DFCP1。PI3P用藍(lán)線表示。還顯示了內(nèi)質(zhì)網(wǎng)定位的跨膜蛋白VMP1，它與IIIPI3K復(fù)合物相互作用。刺激ULK復(fù)合體激活這個(gè)復(fù)合體，它由核心結(jié)構(gòu)(Beclin1，Vps15和Vps34)和兩個(gè)調(diào)節(jié)子(ATG14L和AMBRA1)組成。這種誘導(dǎo)允許PI3P的產(chǎn)生促進(jìn)Wipi蛋白在兩個(gè)泛素樣接合體系統(tǒng)的上游募集，這兩個(gè)泛素樣接合系統(tǒng)延長(zhǎng)并封閉了自噬體膜。第一結(jié)合系統(tǒng)導(dǎo)致形成ATG12-ATG5-ATG16L1復(fù)合物，該復(fù)合物在第二結(jié)合系統(tǒng)中充當(dāng)E3樣酶，其在未結(jié)合形式LC3-I下游產(chǎn)生脂化PE結(jié)合形式的LC3(LC3-II)。

自噬和外體之間新出現(xiàn)的相互作用。現(xiàn)有的數(shù)據(jù)表明，自噬機(jī)制和外體生物發(fā)生之間存在多種可能的相互作用。(A)自噬機(jī)制的子集可能有助于外體的生物發(fā)生。作為一個(gè)例子，這里顯示的是ATG5-ATG16復(fù)合物，它定位于MVB并介導(dǎo)LC3B的非正則脂化。ATG5-ATG16復(fù)合物還有助于V-ATPase的解離，防止MVB的酸化和隨后的溶酶體降解。然后，MVBS與質(zhì)膜(右)融合，釋放外體。(B)兩親體可以與PM融合并分泌其內(nèi)容物。這里顯示的是依賴(lài)自噬的膜聯(lián)蛋白A2(ANXA2)的分泌，其中需要一個(gè)兩親體中間體來(lái)釋放胞質(zhì)ANXA2在外體中。

3.外泌體和miRNA

自第一個(gè)microRNA(miRNA)被發(fā)現(xiàn)以來(lái)的短短二十多年間，miRNA生物學(xué)領(lǐng)域得到了長(zhǎng)足的發(fā)展。對(duì)miRNAs在發(fā)育和疾病中的作用，特別是在癌癥中的作用的深入了解，使miRNAs成為新的治療方法的有吸引力的工具和靶點(diǎn)。功能研究已經(jīng)證實(shí)，miRNA失調(diào)是許多癌癥的原因，miRNA作為腫瘤抑制基因或癌基因(OncomiRs)發(fā)揮作用，miRNA模擬物和靶向miRNA的分子(AnttimiRs)在臨床前開(kāi)發(fā)中顯示出希望。幾種miRNA靶向療法已經(jīng)進(jìn)入臨床開(kāi)發(fā)，包括一種腫瘤抑制因子miRNA miR-34的模擬物，它達(dá)到了治療癌癥的第一階段臨床試驗(yàn)，以及針對(duì)miR-122的抗iRs，它達(dá)到了治療肝炎的第二階段試驗(yàn)。microRNAs(miRNAs)是一類(lèi)非編碼RNA分子，通過(guò)與互補(bǔ)靶mRNA結(jié)合，導(dǎo)致mRNA翻譯抑制或降解，在細(xì)胞分化、增殖和存活過(guò)程中發(fā)揮核心作用。

人類(lèi)miRNAs的生物發(fā)生涉及四種關(guān)鍵酶-DROSHA、Exportin 5、Dizer和Argonaute2(AGO2)的嚴(yán)謹(jǐn)調(diào)控通路。編碼生物發(fā)生途徑相關(guān)酶的基因突變，如DICER、DROSHA、Exportin 1和AGO2在許多癌癥類(lèi)型中都存在，包括神經(jīng)母細(xì)胞瘤、卵巢癌和腎母細(xì)胞瘤。同時(shí)，在體內(nèi)傳遞RNA分子的技術(shù)的進(jìn)步使基于miRNA的療法成為可能。這些構(gòu)建體在其RNA主干上具有各種修飾，以提供更高的穩(wěn)定性和對(duì)核酸酶的保護(hù)。在最初的研究中，將裸露的miRNA模擬物，或編碼在病毒載體中的miRNA模擬物，系統(tǒng)地或局部地注射到目標(biāo)組織部位。

miRNA生物發(fā)生。microRNA(miRNA)生物發(fā)生概述，強(qiáng)調(diào)與miRNA改變相關(guān)的疾病中起作用的關(guān)鍵突變和非調(diào)控因素。miRNA是在一條嚴(yán)謹(jǐn)調(diào)控的跨物種保守的途徑中產(chǎn)生的。miRNA的生物發(fā)生始于RNA聚合酶II的轉(zhuǎn)錄。編碼miRNA的基因大多位于內(nèi)含子區(qū)域，并含有各自的啟動(dòng)子區(qū)域。在RNA Pol II介導(dǎo)的長(zhǎng)初級(jí)轉(zhuǎn)錄本的轉(zhuǎn)錄之后，產(chǎn)生成熟miRNA的兩個(gè)酶切割中的第一個(gè)開(kāi)始。DROSHA是一種III型RNase，與輔因子蛋白Dgcr8一起與初級(jí)miRNA(pri-mi RNA)轉(zhuǎn)錄本結(jié)合。DROSHA中存在的兩個(gè)RNA酶結(jié)構(gòu)域介導(dǎo)了pri-miRNAs的3個(gè)?和5個(gè)?鏈的切割，以產(chǎn)生前miRNA。接下來(lái)，exportin 5-Ran·GTP復(fù)合體介導(dǎo)前mRNAs從細(xì)胞核進(jìn)入胞漿。在那里，RNaseIII Disher和TAR RNA結(jié)合蛋白(TRBP)與前miRNA結(jié)合，并切割末端環(huán)，產(chǎn)生miRNA雙鏈。下一步，將miRNA雙鏈摻入RNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合物(RISC)。miRNA雙鏈的處理是由Argonaute(AGO)蛋白家族介導(dǎo)的，與幾個(gè)輔助因子(如PACT(也稱(chēng)為PRKRA))結(jié)合在一起。經(jīng)過(guò)解離和鏈選擇，成熟的miRNA能夠識(shí)別目標(biāo)。成熟的miRNA與RISC結(jié)合導(dǎo)致具有互補(bǔ)位點(diǎn)的mRNAs靶向，導(dǎo)致翻譯抑制或mRNA降解。如圖10，14-18所示，編碼生物發(fā)生途徑相關(guān)酶的基因突變，如DICER，DROSHA，Exportin 1和AGO2，已在許多癌癥類(lèi)型中被報(bào)道，包括神經(jīng)母細(xì)胞瘤，卵巢癌和腎母細(xì)胞瘤。

4.外泌體和lncRNA

細(xì)胞外小泡(EV)是一種小的膜性小泡，由多種細(xì)胞類(lèi)型分泌，包括凋亡小體、微泡和外泌體。外泌體在多囊內(nèi)小體或多囊小體(MVB)內(nèi)產(chǎn)生，并在這些小室與質(zhì)膜融合時(shí)分泌。外泌體通過(guò)運(yùn)輸細(xì)胞內(nèi)的成分，如蛋白質(zhì)、RNA和DNA，促進(jìn)細(xì)胞間的交流。這些外泌體成分在受體細(xì)胞中具有功能性，并且隨來(lái)源細(xì)胞的不同而變化很大，細(xì)胞在不同的生理和病理?xiàng)l件下可以產(chǎn)生不同的外泌體。大量研究表明，在局部和遠(yuǎn)處的微環(huán)境中，外泌體 是腫瘤細(xì)胞和間質(zhì)細(xì)胞之間細(xì)胞間通訊的重要媒介。外泌體的表面分子允許它們以受體細(xì)胞為靶點(diǎn)。一旦連接到靶細(xì)胞上，外泌體通過(guò)受體-配體的相互作用誘導(dǎo)信號(hào)傳遞，或者通過(guò)內(nèi)吞和/或吞噬作用被內(nèi)化。另一方面，外泌體甚至與靶細(xì)胞的膜融合，將其內(nèi)容物輸送到其胞漿中。外泌體可以從不同的生物體液中分離出來(lái)，例如血液、尿液和唾液。

腫瘤微環(huán)境中的間質(zhì)細(xì)胞也利用外泌體轉(zhuǎn)移影響癌癥發(fā)生和發(fā)展的分子內(nèi)容。MIR-21由網(wǎng)膜腫瘤微環(huán)境中鄰近間質(zhì)細(xì)胞來(lái)源的外泌體遞送，賦予轉(zhuǎn)移性卵巢癌細(xì)胞惡性表型和化療耐藥性。在乳腺癌中，間充質(zhì)干細(xì)胞(MSCs)分泌的外切體可能通過(guò)轉(zhuǎn)移其分子內(nèi)容來(lái)重塑腫瘤行為。MIR-16富含于MSC來(lái)源的外切體中，并通過(guò)靶向血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)發(fā)揮部分抗血管生成作用。

長(zhǎng)鏈非編碼RNA(LncRNAs)在操作上被定義為超過(guò)200個(gè)核苷酸的轉(zhuǎn)錄本，其功能沒(méi)有明顯的蛋白質(zhì)編碼功能。LncRNAs存在于細(xì)胞核或細(xì)胞質(zhì)中，它們可以與DNA、RNA或蛋白質(zhì)相互作用。值得注意的是，lncRNAs被證明通過(guò)直接或間接干擾各種癌癥的基因表達(dá)，在多種生物學(xué)過(guò)程中發(fā)揮重要作用。lncRNA也可以包裝成外切體，在細(xì)胞間的通訊中充當(dāng)信使。值得注意的是，一些lncRNAs富集在外體中，而另一些幾乎不存在，這表明一些lncRNAs選擇性地分選到外體中。特定蛋白可能作為基本的lncRNAs載體來(lái)控制lncRNA分選成外體，但其確切的調(diào)控機(jī)制尚未完全闡明。

孫尼替尼耐藥的腎癌細(xì)胞中基于lncARSR信號(hào)通路的基本原理。通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合miR-34和miR-449，導(dǎo)致Axl/c-met的表達(dá)增加，重新激活STAT3、AKT和ERK信號(hào)，從而促進(jìn)了對(duì)Sunitinib的耐藥性。反過(guò)來(lái)，激活AKT誘導(dǎo)FOXO1或FOXO3a的磷酸化和降解，導(dǎo)致lncARSR的轉(zhuǎn)錄去抑制，從而形成一個(gè)正反饋環(huán)。此外，lncARSR可以被包裝成外體，并從對(duì)孫尼替尼耐藥的腎癌細(xì)胞中分泌出來(lái)，將耐藥性轉(zhuǎn)移到受體敏感的細(xì)胞中。

5.外泌體和免疫系統(tǒng)

炎癥相關(guān)癌癥發(fā)展過(guò)程中先天和適應(yīng)性免疫細(xì)胞功能的模型。早期腫瘤組織中存在的抗原通過(guò)樹(shù)突狀細(xì)胞(DC)轉(zhuǎn)運(yùn)到淋巴器官，激活適應(yīng)性免疫反應(yīng)，從而產(chǎn)生促腫瘤和抗腫瘤作用。在癌癥早期發(fā)展過(guò)程中調(diào)節(jié)DC運(yùn)輸?shù)耐緩胶涂乖拇_切性質(zhì)仍有待確定。B細(xì)胞的激活和體液免疫反應(yīng)導(dǎo)致腫瘤組織中天然免疫細(xì)胞的慢性激活。激活的先天免疫細(xì)胞，如肥大細(xì)胞、粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞，通過(guò)釋放有效的促進(jìn)生存的可溶性分子來(lái)促進(jìn)腫瘤的發(fā)展，這些分子調(diào)節(jié)啟動(dòng)的腫瘤細(xì)胞中的基因表達(dá)程序，最終改變細(xì)胞周期進(jìn)程，提高存活率。炎癥細(xì)胞通過(guò)產(chǎn)生促血管生成介質(zhì)和胞外蛋白酶，積極影響組織重構(gòu)和血管生成的發(fā)育。這些通路長(zhǎng)期參與的組織顯示腫瘤發(fā)展的風(fēng)險(xiǎn)增加。相反，適應(yīng)性免疫的激活除了抗體依賴(lài)的細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性和抗體誘導(dǎo)的補(bǔ)體介導(dǎo)的溶解外，還通過(guò)T細(xì)胞介導(dǎo)的殺傷(通過(guò)誘導(dǎo)Fas、穿孔素和/或細(xì)胞因子途徑)來(lái)誘導(dǎo)抗腫瘤反應(yīng)。

TES在腫瘤免疫環(huán)境中的作用。a)TES呈遞腫瘤抗原，增強(qiáng)抗腫瘤免疫：在樹(shù)突狀細(xì)胞存在的情況下，負(fù)載特異性抗原的TES能夠促進(jìn)腫瘤抗原特異性CD8+細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞的活化。熱休克蛋白70表面陽(yáng)性的TES能刺激NK細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的遷移和溶細(xì)胞活性。b)在大多數(shù)情況下，TES作為免疫抑制因子發(fā)揮作用。例如，含有FasL或TRAIL的TES誘導(dǎo)T細(xì)胞凋亡，抑制T細(xì)胞活化。攜帶轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β的TES促進(jìn)T細(xì)胞增殖，從而抑制免疫應(yīng)答。表達(dá)NKG2D配體或轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1的TES可通過(guò)下調(diào)NK細(xì)胞和CD8T細(xì)胞表面NKG2D的表達(dá)來(lái)抑制NK細(xì)胞和CD8T細(xì)胞的細(xì)胞毒作用。攜帶HSP72基因的TES能激活MDSCs中的STAT3，促進(jìn)MDSCs的抑制功能。含有miR-21-3p、miR-125b-5p、miR-181D-5p和miR-1246等miRNAs的TES將巨噬細(xì)胞重塑為促進(jìn)腫瘤的表型。

來(lái)自不同免疫細(xì)胞的外切體在調(diào)節(jié)癌癥免疫中發(fā)揮著不同的作用。a)攜帶MHC II的B細(xì)胞來(lái)源的外切體激活CD4+T細(xì)胞。DC來(lái)源的外切體含有腫瘤來(lái)源的抗原、共刺激分子和蛋白質(zhì)，可以促進(jìn)CD4+T細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞的活化。攜帶MHC I的巨噬細(xì)胞來(lái)源的外切體可以被轉(zhuǎn)移到DC，從而使其能夠激活抗原特異性的CD4+T細(xì)胞。b)含有CD73的T-reg來(lái)源的外切體可以抑制T細(xì)胞的活化。攜帶MHCⅠ的CD8+T細(xì)胞來(lái)源的外切體也通過(guò)抑制DC的抗原提呈來(lái)介導(dǎo)免疫抑制。

外泌體在癌癥免疫治療中的應(yīng)用。a)由于外泌體在循環(huán)中的穩(wěn)定性高，具有良好的水平載物轉(zhuǎn)運(yùn)能力，已被探索作為藥物或腫瘤靶向RNAi在不同疾病中的遞送載體。此外，外泌體還可以通過(guò)表達(dá)SIRPα、PD1或腫瘤抗原肽等蛋白作為免疫調(diào)節(jié)劑。樹(shù)突狀細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞等免疫細(xì)胞來(lái)源的外體可激發(fā)抗腫瘤免疫反應(yīng)。重要的是，為臨床應(yīng)用產(chǎn)生了大規(guī)模的良好制造規(guī)范級(jí)別(GMP級(jí)別)和臨床級(jí)別的外泌體。b)攜帶GPC1、PD-L1或某些miRNA的外泌體可能是有價(jià)值的癌癥生物標(biāo)志物。c)抑制外泌體的生物生成、釋放和攝取是癌癥免疫治療的另一個(gè)策略。

三.外泌體熱點(diǎn)研究分析

外泌體是近年來(lái)生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)，其在人體內(nèi)廣泛分布，幾乎所有細(xì)胞均可以分泌外泌體，這些外泌體既有共性也有區(qū)別，但來(lái)源于不同細(xì)胞的外泌體在不同的生理、病理階段具有不同的功能。隨著研究的不斷深入，人們對(duì)外泌體的認(rèn)識(shí)一直在快速增長(zhǎng)。與其他任何一個(gè)相對(duì)較新的領(lǐng)域一樣，外泌體是一種令人興奮的生物現(xiàn)象，充滿了希望和疑惑。

從近幾年國(guó)自然的申報(bào)情況來(lái)看，外泌體相關(guān)領(lǐng)域研究越來(lái)越多，大家對(duì)外泌體的研究愈發(fā)重視，自2010年開(kāi)始，國(guó)自然審批通過(guò)的外泌體方向的研究逐漸增加，趨勢(shì)上來(lái)看外泌體研究已經(jīng)成為國(guó)自然熱門(mén)研究方向，本期擬通過(guò)分析近幾年外泌體研究的熱門(mén)研究方向向大家說(shuō)明外泌體研究的策略以及未來(lái)重點(diǎn)研究方向的走向，幫助大家更好的完成相關(guān)領(lǐng)域的研究。

1.外泌體腫瘤耐藥性研究

化療是腫瘤的主要治療方法之一，在控制腫瘤進(jìn)展方面發(fā)揮著重要作用。然而,化療藥物的長(zhǎng)期應(yīng)用通常會(huì)誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞對(duì)藥物產(chǎn)生耐藥性，從而導(dǎo)致治療失敗和疾病進(jìn)展。因此，腫瘤耐藥的機(jī)制及耐藥預(yù)防或逆轉(zhuǎn)策略一直是腫瘤治療研究的熱點(diǎn)問(wèn)題。外泌體(exosomes)是機(jī)體細(xì)胞分泌的一種直徑在40～100 nm之間的小球形囊泡，攜帶多種生物活性小分子(DNA,ncRNA,mRNA,蛋白質(zhì)等)，參與細(xì)胞微環(huán)境的調(diào)節(jié),從而調(diào)控體內(nèi)多種生理和病理活動(dòng)。近年來(lái)研究表明，外泌體作為細(xì)胞-細(xì)胞間耐藥信號(hào)傳遞的媒介,在腫瘤化療耐藥，轉(zhuǎn)移及免疫逃逸等方面發(fā)揮重要作用。大多數(shù)關(guān)于腫瘤耐藥性的研究都集中在腫瘤細(xì)胞本身。由腫瘤細(xì)胞分泌的外泌體充當(dāng)了腫瘤細(xì)胞之間或者微環(huán)境中的各類(lèi)細(xì)胞之間通信的關(guān)鍵介質(zhì)。因此，外泌體已成為腫瘤耐藥性研究的新模式，也成為了腫瘤生物學(xué)耐藥性研究的新熱點(diǎn)。

案例分析：

背景：奧沙利鉑耐藥是晚期結(jié)直腸癌(CRC)治療的主要挑戰(zhàn)。上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)的獲得和腫瘤細(xì)胞內(nèi)藥物積聚的抑制都有助于奧沙利鉑耐藥的發(fā)展。小分子非編碼RNA miR-128-3p的異常表達(dá)在腫瘤的發(fā)生和發(fā)展中起著關(guān)鍵的調(diào)節(jié)作用。然而，它在大腸癌進(jìn)展和奧沙利鉑耐藥中的作用在很大程度上還不清楚。

方法：將miR-128-3p表達(dá)的慢病毒轉(zhuǎn)染奧沙利鉑耐藥的大腸癌細(xì)胞和正常腸道FHC細(xì)胞。轉(zhuǎn)染后分離FHC來(lái)源的外切體，與CRC細(xì)胞共培養(yǎng)。用實(shí)時(shí)定量PCR(RT-qPCR)檢測(cè)耐藥大腸癌細(xì)胞、FHC細(xì)胞和外體中miR-128-3p的表達(dá)。RT-qPCR和Western blot分別檢測(cè)耐藥細(xì)胞miR-128-3p靶基因的mRNA和蛋白水平。采用CCK8、流式細(xì)胞儀、Transwell和傷口愈合試驗(yàn)、免疫熒光和原子吸收分光光度計(jì)檢測(cè)miR-128-3p對(duì)大腸癌細(xì)胞存活率、凋亡率、EMT、運(yùn)動(dòng)能力和藥物外排的影響。采用異種移植模型，觀察負(fù)載miR-128-3p的外切體在體內(nèi)是否能使大腸癌細(xì)胞對(duì)奧沙利鉑再增敏。

結(jié)果：在我們建立的穩(wěn)定的奧沙利鉑耐藥的大腸癌細(xì)胞系中，體內(nèi)外研究顯示miR-128-3p抑制EMT，增加奧沙利鉑在細(xì)胞內(nèi)的蓄積。重要的是，我們的結(jié)果表明，在晚期人類(lèi)大腸癌患者中，miR-128-3p的低表達(dá)與奧沙利鉑療效差有關(guān)。此外，數(shù)據(jù)表明，轉(zhuǎn)染miR-128-3p的FHC細(xì)胞能有效地將miR-128-3p包裝成分泌型外泌體，并介導(dǎo)miR-128-3p轉(zhuǎn)運(yùn)到奧沙利鉑耐藥細(xì)胞，提高了奧沙利鉑對(duì)大腸癌細(xì)胞的體內(nèi)外反應(yīng)。此外，miR-128-3p過(guò)表達(dá)通過(guò)抑制耐藥細(xì)胞中Bmi1的表達(dá)，上調(diào)E-cadherin水平，抑制奧沙利鉑誘導(dǎo)的EMT。同時(shí)，通過(guò)抑制藥物轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白MRP5的表達(dá)，減少奧沙利鉑的外排。

結(jié)論：結(jié)果表明，通過(guò)外切體傳遞miR-128-3p是一種通過(guò)負(fù)調(diào)控Bmi1和MRP5來(lái)增強(qiáng)大腸癌化療敏感性的新策略。此外，miR-128-3p可能是奧沙利鉑為主的化療的一個(gè)有前途的診斷和預(yù)后標(biāo)志物。

大腸癌治療中基于外體miR-128-3p的信號(hào)通路示意圖。在奧沙利鉑耐藥的CRC細(xì)胞中，來(lái)源于FHC-128細(xì)胞的外體miR128-3p通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合Bmi1和MRP5來(lái)逆轉(zhuǎn)奧沙利鉑耐藥，導(dǎo)致E-cadherin表達(dá)增加(抑制EMT表型)，減少奧沙利鉑外排。

2.外部干預(yù)刺激型外泌體研究

案例分析：

背景：轉(zhuǎn)移是肺癌死亡的主要原因。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)是癌癥微環(huán)境的一個(gè)組成部分，對(duì)癌癥的發(fā)展起著重要作用。腫瘤內(nèi)缺氧對(duì)癌細(xì)胞和間質(zhì)細(xì)胞都有影響。胞外體被認(rèn)為是細(xì)胞間通訊的媒介。在這里，我們的目標(biāo)是進(jìn)一步闡明BMSC來(lái)源的外切體與缺氧生態(tài)位中的癌細(xì)胞之間的聯(lián)系。

方法：使用microRNA陣列進(jìn)行外體miRNA圖譜分析。采用肺癌細(xì)胞和小鼠體內(nèi)同基因腫瘤模型，評(píng)價(jià)選擇性外體microRNAs的作用。評(píng)估了低氧骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞來(lái)源的血漿外體miRNAs區(qū)分癌癥患者和非癌癥對(duì)照以及有或沒(méi)有轉(zhuǎn)移的癌癥患者的能力。

結(jié)果：我們證明了低氧骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞來(lái)源的外切體可以被鄰近的癌細(xì)胞攝取，并促進(jìn)癌細(xì)胞的侵襲和EMT。Exosome介導(dǎo)的包括miR-193a-3p、miR-210-3p和miR-5100在內(nèi)的特定microRNAs從BMSCs轉(zhuǎn)移到上皮癌細(xì)胞可以激活STAT3信號(hào)，增加間質(zhì)相關(guān)分子的表達(dá)。單個(gè)microRNA的診斷準(zhǔn)確性表明，血漿外體miR-193a-3p可以區(qū)分癌癥患者和非腫瘤對(duì)照。這三組血漿胞外體microRNA對(duì)肺癌患者有無(wú)轉(zhuǎn)移的診斷準(zhǔn)確率比單獨(dú)的胞外體microRNA更高。

結(jié)論：Exosome介導(dǎo)的miR-193a-3p、miR-210-3p和miR-5100基因轉(zhuǎn)染可通過(guò)激活STAT3信號(hào)誘導(dǎo)的EMT促進(jìn)肺癌細(xì)胞的侵襲。這些外體miRNAs可能是癌癥進(jìn)展的有前途的非侵入性生物標(biāo)記物。

BMSCs外體miRNAs通過(guò)STAT3介導(dǎo)的EMT促進(jìn)腫瘤轉(zhuǎn)移。C57BL/6小鼠皮下注射LLC-RFP(含或不含骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞)。通過(guò)流式細(xì)胞儀細(xì)胞分選，從腫瘤部位收集紅色熒光蛋白陽(yáng)性的LLC細(xì)胞，進(jìn)行RNA測(cè)序分析。上調(diào)的基因在JAK-STAT途徑中富集。對(duì)從接受BMSCs聯(lián)合注射和LLC或LLC單獨(dú)注射的小鼠收集的LLC細(xì)胞之間的差異表達(dá)的mRNA進(jìn)行聚類(lèi)。直方圖顯示RNA-Seq獲得的STAT3轉(zhuǎn)錄本的FPKM。Western blot檢測(cè)STAT3、p-STAT3的B蛋白表達(dá)。用常氧的BMSC分泌的外切體或缺氧的BMSC分泌的外切體處理細(xì)胞。以β-肌動(dòng)蛋白作為內(nèi)對(duì)照。用Transwell法測(cè)定C細(xì)胞侵襲力。STAT3抑制劑他汀類(lèi)藥物可逆轉(zhuǎn)缺氧BMSC分泌的外切體增加的侵襲能力。放大倍率為100倍。用實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)Snail和Vimentin的D表達(dá)。細(xì)胞用缺氧的BMSC分泌的外切體加或不加STAT3抑制劑他汀類(lèi)藥物處理。

3.外泌體磷酸化，泛素化機(jī)制研究

案例分析：

腫瘤細(xì)胞分泌的外泌體參與了腫瘤間質(zhì)環(huán)境的重塑和促進(jìn)惡性腫瘤的發(fā)生。然而，控制腫瘤外切體釋放的機(jī)制仍然不完全清楚。在這里，我們發(fā)現(xiàn)腫瘤細(xì)胞外泌體的分泌是由丙酮酸激酶M2(PKM2)控制的，該蛋白在腫瘤中被上調(diào)和磷酸化。在胞外體分泌過(guò)程中，磷酸化的PKM2作為蛋白激酶磷酸化突觸體相關(guān)蛋白23(SNAP-23)，進(jìn)而形成SNARE復(fù)合體，使胞外體釋放。直接磷酸化實(shí)驗(yàn)和質(zhì)譜分析證實(shí)PKM2在Ser95位磷酸化SNAP-23。非磷酸化SNAP-23突變體(Ser95-Ala95)的異位表達(dá)顯著減少了PKM2介導(dǎo)的外切體釋放，而選擇性擬磷酸化SNAP-23突變體(Ser95-Glu95，而不是Ser20-Glu20)的表達(dá)則挽救了PKM2基因敲除引起的受損的外切體釋放。我們的發(fā)現(xiàn)揭示了PKM2的非代謝功能，PKM2是一種與腫瘤細(xì)胞對(duì)有氧糖酵解的依賴(lài)相關(guān)的酶，在促進(jìn)腫瘤細(xì)胞外切體釋放方面起著重要作用。

腫瘤細(xì)胞外切體的釋放依賴(lài)于有氧糖酵解。(a-c)用透射電鏡(a)、WB(b)和NTA(c)鑒定從A549細(xì)胞中分離的外泌體。a中右下角的圖像代表外泌體中CD63的免疫金標(biāo)記物。腫瘤細(xì)胞比非腫瘤細(xì)胞釋放更多的外泌體。(e)外泌體分泌與有氧糖酵解呈正相關(guān)。(f)葡萄糖攝取量與乳酸水平之間的線性回歸。(g)外泌體的釋放依賴(lài)于細(xì)胞的有氧糖酵解。用紫草素(1 μM)或腫瘤壞死因子a(5 ngml-1)處理細(xì)胞，以抑制或促進(jìn)有氧糖酵解。治療24 h后測(cè)定外切體濃度。(h)EGF和OA對(duì)細(xì)胞有氧糖酵解的影響。值得注意的是，EGF(10 ngml-1)，外切體釋放的促進(jìn)劑，增加有氧糖酵解，而OA(10 mgm-1)，外切體釋放的抑制劑，減少有氧糖酵解。(i)EGF和OA通過(guò)改變細(xì)胞有氧糖酵解來(lái)調(diào)節(jié)A549細(xì)胞外切體的釋放。數(shù)據(jù)以平均值±S.E.M表示。并且表示每個(gè)數(shù)據(jù)點(diǎn)具有三個(gè)重復(fù)的至少三個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)。

4.外泌體分選及分泌機(jī)制研究

案例分析：

蘇尼替尼耐藥是晚期腎細(xì)胞癌(RCC)面臨的主要挑戰(zhàn)。了解蘇尼替尼耐藥的潛在機(jī)制，制定有效的抗耐藥策略，是臨床上迫切需要解決的問(wèn)題。在這里，我們發(fā)現(xiàn)了一個(gè)lncRNA，命名為lncARSR(在具有蘇尼替尼耐藥的腎癌中激活的lncRNA)，它與臨床上較差的蘇尼替尼反應(yīng)相關(guān)。LncARSR通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合miR-34/miR-449促進(jìn)AXL和c-met在腎癌細(xì)胞中的表達(dá)，從而促進(jìn)對(duì)舒尼替尼的耐藥性。此外，生物活性的lncARSR可以被整合到外切體中并傳遞給敏感細(xì)胞，從而傳播對(duì)孫尼替尼的耐藥性。靶向incARSR或axl/c-met抑制劑的鎖定核酸治療對(duì)舒尼替尼耐藥的腎癌恢復(fù)了舒尼替尼的反應(yīng)。因此，lncARSR可作為舒尼替尼耐藥的預(yù)測(cè)指標(biāo)和潛在的治療靶點(diǎn)。

lncARSR的鑒定及其對(duì)蘇尼替尼耐藥的影響。(A)描述獲得對(duì)蘇尼替尼耐藥的腎癌細(xì)胞過(guò)程的示意圖模型。(B)左：耐舒尼替尼細(xì)胞和親本細(xì)胞的lncRNA微陣列數(shù)據(jù)顯示在熱圖中。右圖：指示樣本中非調(diào)控LncRNA篩選流程圖。(C)人類(lèi)染色體9q82.120.717-82.185.824上lncARSR基因組位點(diǎn)的示意圖注釋。綠色矩形代表外顯子。(D)用LNA探針對(duì)Sonitinib抗性細(xì)胞和親本細(xì)胞中的lncARSR進(jìn)行Northern blot分析。以B-肌動(dòng)蛋白作為載藥對(duì)照。(E)定量RT-PCR分析復(fù)發(fā)組(9例)、新輔助組(12例)和初治組(8例)腎癌組織中LncARSR的表達(dá)。將lncARSR表達(dá)歸一化為b-actin(DCT)，并與最大DCT進(jìn)行比較。數(shù)據(jù)以？DDCT表示。(F)在舒尼替尼治療前(治療前)和在舒尼替尼治療期間疾病進(jìn)展之后(復(fù)發(fā)后)，用LNA探針對(duì)配對(duì)的腎癌組織中的lncARSR進(jìn)行LNA ISH分析。

5.外泌體功能機(jī)制研究

胰島素抵抗是2型糖尿病的主要病理特征，老年人常出現(xiàn)胰島素抵抗。然而，與衰老相關(guān)的胰島素抵抗的深層次機(jī)制仍不清楚。在這里，我們發(fā)現(xiàn)老年小鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BM-MSCs)釋放的納米外切體可以被脂肪細(xì)胞、心肌細(xì)胞和肝細(xì)胞攝取，導(dǎo)致體內(nèi)和體外的胰島素抵抗。通過(guò)microRNA(MiRNA)陣列檢測(cè)，我們發(fā)現(xiàn)老年小鼠BM-MSCs釋放的外切體miR-29b-3p的數(shù)量顯著增加。從機(jī)制上講，SIRT1(Sirtuin1)被認(rèn)為是外體miR-29b-3p調(diào)節(jié)胰島素抵抗的下游靶點(diǎn)。值得注意的是，利用適體介導(dǎo)的納米復(fù)合物遞送系統(tǒng)下調(diào)BM-MSCs來(lái)源的外體中miR-29b-3p的水平，顯著改善了老年小鼠的胰島素抵抗。同時(shí)，BM-MSCs特異性過(guò)表達(dá)miR-29b-3p誘導(dǎo)幼鼠胰島素抵抗。綜上所述，這些發(fā)現(xiàn)提示BM-MSCs來(lái)源的胞外體miR-29b-3p可以調(diào)節(jié)衰老相關(guān)的胰島素抵抗，這可能成為衰老相關(guān)胰島素抵抗的潛在治療靶點(diǎn)。

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